jedno podejście do terapii genowej, która ma duży potencjał, nazywa CRISPR (skupione regularnie przeplatane krótkie powtórzenia palindromiczne). CRISPR został odkryty kilkadziesiąt lat temu w bakteriach, gdzie służył jako część systemu obronnego przed wirusami infekującymi bakterie. W tych bakteriach inwazyjne wirusy wstawiają kluczowe części swojego materiału genetycznego do materiału genetycznego bakterii. Te wstawione geny wirusowe następnie produkują białka i inne cząsteczki, które porywają komórkę i przekształcają ją w mini fabrykę wirusów, kontynuując cykl życia inwazyjnego wirusa i ostatecznie niszcząc bakterie.
CRISPR zawiera małe kawałki materiału genetycznego wirusa, które można wykorzystać do badania genów bakterii pod kątem obecności DNA wirusa. Oznacza to, że CRISPR jest używany do przesiewania DNA bakterii pod kątem sygnałów infekcji wirusowej—obecności wirusowego DNA. Po wykryciu wirusowego DNA, CRISPR wykorzystuje enzym o nazwie Cas9 (białko związane z CRISPR 9), aby usunąć lub edytować niechciane wirusowe DNA. Usuwając wirusowe DNA, bakterie są chronione przed skutkami infekcji wirusowej.
połączenie CRISPR-Cas ma wiele potencjalnych zastosowań. W szczególności CRISPR-Cas może leczyć dziedziczne zaburzenia, takie jak hemofilia i niektóre choroby zakaźne, takie jak HIV. W przypadku pozostałych naszych sprawozdań na temat CRISPR-Cas będziemy po prostu odnosić się do niego jako CRISPR. Przed dalszą dyskusją na temat CRISPR przedstawiamy pewne tło na temat infekcji komórki HIV, dystrybucji wirusa w organizmie i niektórych skutków sztuki.
usuwanie wirusa HIV
podobnie jak wcześniejszy przykład wirusa, który zainfekował bakterie, zasadniczo podobny proces dotyczy komórek układu odpornościowego ukierunkowanego na HIV. Komórki, które wyświetlają receptor CD4 na swojej powierzchni (jak również Ko-receptory CCR5 i CXCR4)mogą być zakażone wirusem HIV. Takie komórki obejmują głównie niektóre limfocyty T (komórki T) powszechnie nazywane limfocytami T CD4 (lub po prostu komórki CD4+), a także komórki zwane monocytami (w ich dojrzałej formie nazywane są makrofagami) i komórki związane z makrofagami (takie jak komórki dendrytyczne w skórze i tkankach śluzówki oraz mikroglej w mózgu). Po tym, jak HIV wprowadza swój materiał genetyczny do komórek docelowych, mogą one zostać aktywowane, przekształcając się w mini fabryki wirusów i ostatecznie umierając.
ART i zbiornik HIV
leczenie HIV (ART) jest wysoce skuteczne, gdy jest przyjmowane zgodnie z zaleceniami i zaleceniami. W rezultacie naukowcy coraz częściej oczekują, że wielu użytkowników dzieł sztuki będzie miało prawie normalną długość życia. Jednak sztuka nie leczy HIV. Przyczyny tego nie są pewne, ale niektóre eksperymenty sugerują, że pomimo dobrego przestrzegania sztuki i niewykrywalnego miana wirusa we krwi, małe ilości HIV pozostają głęboko w organizmie – w węzłach chłonnych, mózgu, częściach jelit, tkance tłuszczowej, jądrach i tak dalej. Naukowcy odnoszą się do tych części ciała, w których niewielkie ilości HIV nadal czają się pomimo stosowania sztuki jako sanktuaria lub zbiorniki.
Nano-Sztuka
od co najmniej dekady naukowcy z University of Nebraska opracowują to, co nazywają nano-preparatami sztuki—bardzo małe kryształy leków otoczone kulą tłuszczu. Te wypełnione lekami kulki tłuszczu przenikają do szeregu tkanek w doświadczeniach laboratoryjnych i na zwierzętach, gdzie mają dobrą aktywność anty-HIV. Jednak krótkoterminowe eksperymenty wykazały, że nano-sztuka sama w sobie nie leczy zakażenia HIV u myszy laboratoryjnych.
powrót do CRISPR
eksperymenty z myszami zakażonymi wirusem HIV wykazały, że CRISPR może usunąć dużą część DNA HIV z zakażonych komórek. Jednak CRISPR sam w sobie nie leczy zakażenia HIV u myszy.
łączenie nano-sztuki i CRISPR
w ostatnich eksperymentach naukowcy z University of Nebraska współpracowali z innymi naukowcami z Temple University w Filadelfii, którzy mają doświadczenie z CRISPR. Przeprowadzili serię bardzo złożonych i szczegółowych eksperymentów na myszach zakażonych HIV, które otrzymały jedną z następujących interwencji:
- nano-ART
- CRISPR
- nano-ART + CRISPR
- brak interwencji
Nano-ART użyty w tych eksperymentach został wykonany z trzech powszechnie stosowanych leków przeciw HIV w następujący sposób:
- dolutegrawir + 3TC + abakawir
preparat o natychmiastowym uwalnianiu wszystkich trzech leków jest sprzedawany jako pigułka o nazwie Triumeq i jest przyjmowany raz na dobę.
CRISPR był używany do wyszukiwania kluczowych fragmentów materiału genetycznego HIV w komórkach układu odpornościowego myszy.
obszerna analiza krwi i tkanek myszy sugerowała, że połączenie nano-artu i CRISPR było w stanie usunąć HIV z około 30% myszy. Nie było oczywistej toksyczności.
wyniki połączenia nano-artu i CRISPR są ekscytujące, ale należy je uznać za wstępne. Sugerują, że pewnego dnia taka kombinacja może być w stanie wyleczyć niektóre małpy zakażone SIV (simian immunodeficiency virus)—wirusem, który powoduje stan podobny do AIDS u wrażliwych małp. Wyniki sugerują również możliwość wykorzystania CRISPR + nano-ART do próby wyleczenia zakażenia HIV u ludzi. Jednak nadal istnieje wiele kroków, które czekają i kwestie, które należy zbadać, zanim nano-ART i CRISPR będą gotowe do użycia u ludzi. Poniżej znajdują się niektóre z tych problemów.
CRISPR-Bezpieczeństwo i inne kwestie
pisząc o ekscytujących wiadomościach na temat pracy wykonanej w laboratorium badawczym dotyczącej leczenia HIV lub innych katastroficznych warunków, należy podkreślić, że myszy nie są ludźmi. Oznacza to, że gdyby każda eksperymentalna terapia, która nie szkodziła myszom, działała bezpiecznie i skutecznie u ludzi, mielibyśmy o wiele więcej wysoce skutecznych terapii dostępnych dla różnych warunków.
oprócz usuwania materiału genetycznego HIV z myszy, możliwe jest, że CRISPR może nieumyślnie usunąć użyteczne DNA z komórek. Miało to miejsce w niektórych eksperymentach przeprowadzonych przez innych naukowców, ale nie w obecnej współpracy. Usunięcie użytecznego DNA przez CRISPR jest nazywane przez naukowców efektem „poza celem”. Do tej pory zespół współpracujący nad wykorzystaniem nano-artu i CRISPR z myszami nie znalazł żadnych efektów poza celem.
CRISPR jest również stosowany do usuwania SIV z niektórych zakażonych małp. Wstępne wyniki tych eksperymentów wydają się obiecujące. Jednakże, ponieważ niektóre gatunki małp są bardziej genetycznie podobne do ludzi niż myszy, konieczna jest długoterminowa obserwacja i ścisłe monitorowanie kliniczne małp, które były leczone CRISPR (i nano-ART), aby ocenić możliwość wystąpienia jakichkolwiek długoterminowych skutków ubocznych. Badania długoterminowe są ważne, ponieważ konsekwencje CRISPR poza celem mogą nie stać się widoczne przez jakiś czas-być może lata. Takie monitorowanie jest również niezbędne, ponieważ obecnie nie można ocenić każdej komórki w organizmie, aby dowiedzieć się, czy jej DNA nie zostało przypadkowo uszkodzone przez CRISPR.
nie jest jasne, jak CRISPR można wyłączyć u osób, które go otrzymują. Może nie być bezpieczne pozostawienie CRISPR stale włączonego i aktywowanego u żywej osoby.
w eksperymentach przeprowadzonych przez zespół Nebraska-Filadelfia wydaje się, że myszy zostały zainfekowane nieszkodliwym wirusem, który został zmodyfikowany, aby umożliwić CRISPR. Nie jest jasne, czy ta sama technologia będzie działać w ludziach.
Nano-ART—safety and other issues
preparaty sztuki używane przez zespół naukowców z Nebraski-Filadelfii zostały opracowane w laboratorium na małą skalę i przeznaczone do stosowania u myszy. Jeśli planuje się dużą liczbę eksperymentów małp i ludzi z takimi preparatami, naukowcy będą musieli produkować nano-sztukę na stosunkowo dużą skalę. Będą również musieli zapewnić, że taka nano-sztuka jest wolna od wszelkich zanieczyszczeń. Następnie będą musieli ocenić krótko-i długoterminowe bezpieczeństwo stosowania leku u małp i ludzi. Nano-ART będzie w stanie przenikać i koncentrować się w zbiornikach w organizmie, w tym w mózgu, jelitach, węzłach chłonnych, jądrach i tak dalej. Wpływ nano-artu na zdrowie tych tkanek należy ocenić i w pełni zrozumieć. Po przejściu wstępnych eksperymentów bezpieczeństwa, nano-ART będzie musiał zostać przetestowany zarówno pod kątem długoterminowego bezpieczeństwa, jak i skuteczności w osiągnięciu supresji wirusa. Nano-sztuka sama w sobie jest mało prawdopodobne, aby wyleczyć HIV.
kolejny problem z nano-Artem to określenie idealnego sposobu na dostanie się tego preparatu do organizmu. Czy regularna infuzja dożylna jest najlepsza? Czy też inne metody, takie jak wstrzyknięcie domięśniowe, działają równie dobrze?
CRISPR obecnie w badaniach klinicznych
obecnie trwają badania kliniczne z CRISPR u osób zakażonych HIV w następujących krajach w następujących warunkach:
Stany Zjednoczone
- rak niektórych białych krwinek – jedna osoba
- rak, który pojawia się w pobliżu stawów – jedna osoba
Chiny
- niedrobnokomórkowy rak płuc, który rozprzestrzenił się na inne narządy-12 osób
wstępne wyniki tych eksperymentów na ludziach sugerują, że do tej pory CRISPR jest bezpieczny. Potrzeba więcej czasu, zanim lekarze dowiedzą się, czy CRISPR będzie działać w tych przypadkach. Jednak niektórzy naukowcy i lekarze ostrzegli, że edycja genów może nieumyślnie umożliwić rozprzestrzenianie się komórek nowotworowych u niektórych z tych osób. Dlatego konieczne będzie długoterminowe monitorowanie uczestników leczonych CRISPR w powyższych badaniach.
pamiętaj
ważne jest, aby pamiętać, że około 30% myszy zakażonych HIV w badaniu Nebraska-Filadelfia zostało wyleczonych z HIV za pomocą połączonego zastosowania nano-artu i CRISPR. To niesamowite osiągnięcie naukowe. Jednak szybkość utwardzania musi wzrosnąć w przyszłych eksperymentach. CRISPR i nano – arteterapia są jeszcze w powijakach i wiele badań czeka, zanim można je przetestować na dużej liczbie osób zakażonych wirusem HIV.
aby osiągnąć wskaźnik utwardzania wyższy niż 30% wskaźnik utwardzania zgłoszony w niniejszym badaniu, jest co najmniej prawdopodobne, że w przyszłości CRISPR może wymagać rafinacji. Intensyfikacja możliwości edycji CRISPR może nieumyślnie zwiększyć ryzyko usunięcia ważnych ludzkich genów.
inną możliwością jest to, że oprócz CRISPR i nano-ART, konieczne będzie zastosowanie bardziej eksperymentalnych terapii. Stosowanie wielu terapii eksperymentalnych u osób żyjących z HIV może zwiększyć potencjalne problemy, zwłaszcza skutki uboczne. Jest to kolejny powód do ścisłego monitorowania laboratoryjnego i klinicznego zwierząt i ludzi, którzy przechodzą CRISPR, zarówno w perspektywie krótko-i długoterminowej.
istnieje również inna kwestia związana z CRISPR i innymi potencjalnymi terapiami leczącymi HIV, które omawiamy w następnym artykule w tym numerze TreatmentUpdate.
Resources
TreatmentUpdate 231
the Canadian HIV Cure Enterprise (CanCURE)
—Sean R. Hosein
- Dash PK, Kaminski R, Bella R, et al. Sekwencyjne zabiegi laserowe i CRISPR eliminują HIV – 1 w podgrupie zakażonych humanizowanych myszy. Nature Communications. 2019 Jul 2;10(1):2753.
- Panfil AR, London JA, Green PL, et al. Edycja genomu CRISPR / Cas9 w celu wyłączenia utajonego provirusa HIV – 1. Frontiers in Microbiology. 14 grudnia 2018;9: 3107.
- Wang L, Yang y, Breton CA, et al. Ukierunkowanie genów in vivo za pośrednictwem CRISPR / Cas9 koryguje hemostazę u noworodków i dorosłych myszy z nokautem czynnika IX. Krew. 2019 Jun 27; 133(26): 2745-2752.
- Pipe SW, Selvaraj SR. Edycja genów w hemofilii: wybór „CRISPR”? Krew. 2019 Jun 27;133(26):2733-2734.