jeden přístup k genové terapii, který má velký potenciál, se nazývá CRISPR (seskupené pravidelně interspaced krátké palindromické opakování). CRISPR byl objeven před několika desítkami let v bakteriích, kde sloužil jako součást obranného systému proti virům, které infikují bakterie. V těchto bakteriích napadající viry vkládají klíčové části svého genetického materiálu do genetického materiálu bakterií. Tyto Vložené virové geny pak produkují proteiny a další molekuly, které unášejí buňku a přeměňují ji na továrnu na mini viry, pokračují v životním cyklu napadajícího viru a nakonec ničí bakterie.
CRISPR obsahuje malé kousky genetického materiálu viru, které lze použít k screeningu genů bakterií na přítomnost DNA viru. To znamená, že CRISPR se používá k screeningu DNA bakterií na signály virové infekce-přítomnost virové DNA. Jakmile je detekována virová DNA, CRISPR pak používá enzym zvaný Cas9 (CRISPR-asociovaný protein 9) k odstranění nebo úpravě nežádoucí virové DNA. Odstraněním virové DNA jsou bakterie chráněny před účinky virové infekce.
kombinace CRISPR-Cas má mnoho potenciálních aplikací. CRISPR-Cas má zejména potenciál léčit dědičné poruchy, jako je hemofilie a některá infekční onemocnění, jako je HIV. Pro zbytek našich zpráv o CRISPR-Cas, budeme jednoduše odkazovat na to jako CRISPR. Před další diskusí o CRISPR, poskytujeme některé pozadí HIV infekce buňky, distribuce viru v těle a některé účinky čl.
odstranění HIV
stejně jako předchozí příklad viru, který infikoval bakterie, podobně podobný proces ovlivňuje buňky imunitního systému, na které se HIV zaměřuje. Buňky, které zobrazují receptor CD4 na svém povrchu (stejně jako Ko-receptory CCR5 a CXCR4), mohou být infikovány HIV. Takové buňky zahrnují hlavně určité T lymfocyty (T-buňky) běžně nazývané CD4 T-buňky (nebo jednoduše CD4 + buňky), stejně jako buňky zvané monocyty (ve své zralé formě se nazývají makrofágy) a buňky související s makrofágy (jako jsou dendritické buňky v kůži a slizničních tkáních a mikroglie v mozku). Poté, co HIV vloží svůj genetický materiál do cílových buněk, mohou se aktivovat, přeměňují se na továrny na mini viry a nakonec umírají.
ART a rezervoár HIV
léčba HIV (ART) je vysoce účinná, pokud je užívána podle pokynů a předepsaných pokynů. Výsledkem je, že vědci stále více očekávají, že mnoho uživatelů umění bude mít téměř normální délku života. Umění však HIV neléčí. Důvody nejsou jisté, ale některé experimenty naznačují, že i přes dobré dodržování ART a nezjistitelnou virovou zátěž v krvi zůstávají malá množství HIV hluboko v těle-v lymfatických uzlinách, mozku,částech střeva, tukové tkáni, varlatech a tak dále. Vědci odkazují na tyto části těla, kde malé množství HIV stále číhá navzdory použití umění jako svatyně nebo nádrže.
Nano-ART
po dobu nejméně deseti let vědci z University of Nebraska vyvíjejí to, čemu říkají nano-formulace umění-velmi malé krystaly léčiv obklopené sférou tuku. Bylo zjištěno, že tyto tukové kuličky naplněné léky pronikají do řady tkání v laboratorních a zvířecích experimentech, kde mají dobrou anti-HIV aktivitu. Krátkodobé experimenty však zjistily, že nano-umění samo o sobě nevyléčí infekci HIV u laboratorních myší.
zpět na CRISPR
experimenty s myší infikovanými HIV zjistily, že CRISPR může odstranit většinu DNA HIV z infikovaných buněk. CRISPR však sám o sobě nevyléčí infekci HIV u myší.
kombinace nano-umění a CRISPR
v nedávných experimentech vědci z University of Nebraska spolupracovali s dalšími vědci z Temple University ve Filadelfii, kteří mají odborné znalosti s CRISPR. Provedli řadu velmi složitých a podrobných experimentů s myší infikovanými HIV, které obdržely jeden z následujících zásahů:
- nano-ART
- CRISPR
- nano-ART + CRISPR
- žádný zásah
nano-ART použitý v těchto experimentech byl vyroben ze tří široce používaných léků proti HIV následovně:
- dolutegravir + 3TC + abakavir
formulace všech tří léků s okamžitým uvolňováním se prodává jako pilulka zvaná Triumeq a užívá se jednou denně.
CRISPR byl použit k hledání klíčových kusů genetického materiálu HIV v buňkách imunitního systému myší.
rozsáhlá analýza krve a tkání z myší naznačila, že kombinace nano-ART a CRISPR dokázala odstranit HIV z přibližně 30% myší. Nebyla zřejmá toxicita.
výsledky kombinace nano-ART a CRISPR jsou vzrušující, ale musí být považovány za předběžné. Naznačují, že jednoho dne by taková kombinace mohla být schopna vyléčit některé opice infikované virem SIV (opičí imunodeficience) – virem, který způsobuje onemocnění podobné AIDS u vnímavých opic. Výsledky také naznačují možnost, že CRISPR + nano-ART by mohl být použit k pokusu o vyléčení infekce HIV u lidí. Stále však existuje mnoho kroků, které leží před námi, a problémy, které je třeba prozkoumat, než budou nano-ART a CRISPR připraveny k použití u lidí. Níže jsou uvedeny některé z těchto problémů.
CRISPR-bezpečnost a další otázky
při podávání zpráv o vzrušujících zprávách o práci ve výzkumné laboratoři týkající se léčby HIV nebo jiných katastrofických stavů je třeba zdůraznit, že myši nejsou lidé. To znamená, že pokud by každá experimentální terapie, která nepoškodila myši, také fungovala bezpečně a efektivně u lidí, měli bychom k dispozici mnohem více vysoce účinných terapií pro různé podmínky.
kromě odstranění genetického materiálu HIV z myší je možné, že CRISPR může neúmyslně odstranit užitečnou DNA z buněk. To se stalo v některých experimentech prováděných jinými vědci, ale ne v současné spolupráci. Odstranění užitečné DNA pomocí CRISPR se vědcům nazývá efekt „mimo cíl“. Dosud tým spolupracující na používání nano-ART a CRISPR s myší nenalezl žádné mimoúčelové efekty.
CRISPR se také používá k odstranění SIV z některých infikovaných opic. Předběžné výsledky těchto experimentů se zdají slibné. Vzhledem k tomu, že některé druhy opic jsou geneticky podobnější lidem než myši, je nutné dlouhodobé pozorování a pečlivé klinické sledování opic, které byly léčeny přípravkem CRISPR (a nano-ART), aby bylo možné posoudit potenciál jakýchkoli dlouhodobých vedlejších účinků. Dlouhodobé studie jsou důležité, protože off-cílové důsledky CRISPR nemusí být zřejmé po určitou dobu-možná roky. Takové sledování je také nezbytné, protože v současné době není možné posoudit každou buňku v těle, aby se zjistilo, zda její DNA byla neúmyslně zraněna CRISPR.
není jasné, jak lze CRISPR vypnout u lidí, kteří jej dostávají. Nemusí být bezpečné nechat CRISPR neustále zapnutý a aktivovaný u živého člověka.
v experimentech prováděných týmem Nebraska-Philadelphia se zdá, že myši byly infikovány neškodným virem, který byl upraven tak, aby umožnil CRISPR. Není jasné, zda by stejná technologie fungovala u lidí.
Nano-ART-safety and other issues
formulace ART používané týmem vědců Nebraska-Philadelphia byly vyvinuty v laboratoři v malém měřítku a určeny pro použití u myší. Pokud se plánuje velké množství experimentů s opicemi a lidmi s takovými formulacemi, vědci budou muset vyrábět nano-umění v relativně velkém měřítku. Budou také muset zajistit, aby takové nano-umění neobsahovalo žádné nečistoty. Dále budou muset posoudit jeho krátkodobou a dlouhodobou bezpečnost u opic a lidí. Nano-ART bude schopen proniknout a soustředit se v nádržích v těle, včetně mozku, střeva, lymfatických uzlin, varlat a tak dále. Vliv nano-umění na zdraví těchto tkání je třeba posoudit a plně pochopit. Poté, co prošel počátečními bezpečnostními experimenty, nano-ART bude muset být testován jak z hlediska dlouhodobé bezpečnosti, tak z hlediska účinnosti při dosažení virové suprese. Nano-umění samo o sobě pravděpodobně nevyléčí HIV.
dalším problémem nano-artu je určení ideálního způsobu, jak dostat tuto formulaci do těla. Je pravidelná intravenózní infuze nejlepší? Nebo budou jiné metody, jako je intramuskulární injekce, fungovat stejně dobře?
CRISPR v současné době v klinických studiích
klinické studie v současné době probíhají s CRISPR u HIV negativních lidí v následujících zemích za následujících podmínek:
Spojené státy
- rakovina některých bílých krvinek-jedna osoba
- rakovina, která se objeví v blízkosti kloubů-jedna osoba
Čína
- nemalobuněčný karcinom plic, který se rozšířil do dalších orgánů – 12 lidí
předběžné výsledky těchto experimentů u lidí naznačují, že zatím je CRISPR Bezpečný. Než lékaři zjistí, zda bude CRISPR v těchto případech fungovat, je zapotřebí více času. Někteří vědci a lékaři však varovali, že editace genů by mohla neúmyslně umožnit šíření rakovinných buněk u některých z těchto lidí. Proto bude nutné dlouhodobé sledování účastníků léčených CRISPR ve výše uvedených studiích.
mějte na paměti
je důležité poznamenat, že asi 30% myší infikovaných HIV ve studii Nebraska-Philadelphia bylo vyléčeno z HIV kombinovaným použitím nano-ART a CRISPR. To je neuvěřitelný vědecký úspěch. V budoucích experimentech se však musí zvýšit míra vyléčení. CRISPR a nano-ART terapie jsou stále v plenkách a mnoho výzkumů leží před tím, než mohou být testovány na velkém počtu HIV pozitivních lidí.
k dosažení míry vyléčení vyšší než 30% míra vyléčení uvedená v této studii je přinejmenším pravděpodobné, že v budoucnu bude možná nutné CRISPR vylepšit. Zesílení editační kapacity CRISPR může neúmyslně zvýšit riziko odstranění životně důležitých lidských genů.
další možností je, že kromě CRISPR a nano-ART bude třeba použít více experimentálních terapií. Použití více experimentálních terapií u lidí žijících s HIV by mohlo zvýšit potenciální problémy, zejména vedlejší účinky. To je další důvod pro pečlivé laboratorní a klinické sledování zvířat a lidí, kteří podstoupí CRISPR, a to jak krátkodobě, tak dlouhodobě.
existuje také další problém spojený s CRISPR a dalšími potenciálními terapiemi léčby HIV, o kterých diskutujeme v dalším článku v tomto čísle TreatmentUpdate.
zdroje
TreatmentUpdate 231
the Canadian HIV Cure Enterprise (CanCURE)
– Sean R— Hosein
- Dash PK, Kaminski R, Bella R, et al. Sekvenční laserové ošetření ART a CRISPR eliminují HIV-1 v podskupině infikovaných humanizovaných myší. Přírodní Komunikace. 2019 července 2; 10 (1): 2753.
- Panfil AR, London JA, Green PL, et al. CRISPR / Cas9 editace genomu zakázat latentní HIV-1 provirus. Hranice v mikrobiologii. 2018 prosince 14; 9: 3107.
- Wang L, Yang Y, Breton CA, et al. CRISPR / Cas9-zprostředkované cílení na gen in vivo koriguje hemostázu u novorozených a dospělých myší s knockoutem faktoru IX. Krev. 2019 Června 27; 133 (26): 2745-2752.
- Pipe SW, Selvaraj SR. Editace genů v hemofilii: volba“ CRISPR“? Krev. 2019 Června 27; 133 (26): 2733-2734.